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Quel est le rôle du chloroforme pendant l'extraction des ARNm? Toute méthode d?extraction des acides nucléiques comprend une étape préalable de lyse cellulaire et d?inactivation des nucléases afin de préserver l?intégrité des ARN contenus dans chaque cellule. À l?exception des tissus qui subiront une étape préalable de pulvérisation avant toute lyse, lyse et homogénéisation seront menées en parallèle dans tous les autres cas. Il existe différentes méthodes de lyse cellulaire mécaniques ou enzymatiques selon les types cellulaires (tableau 1). Si les méthodes mécaniques sont plutôt dévolues aux cellules et aux tissus, les méthodes enzymatiques sont réservées aux bactéries, aux levures et aux virus afin de dissoudre des structures (capsides, membranes bactériennes...) inaccessibles à la rupture mécanique. La lyse mécanique peut être réalisée après une congélation-flash dans l?azote liquide à l?aide d?un mortier-pilon ou d?un broyeur type Hybaid® Ribolyser ou Mixer Mill MM300® (Qiagen). Ce dernier fait subir à l?échantillon à la fois agitation et torsion à forte vitesse permettant la rupture des cellules, sous l?action de billes de céramique et de détergents. On emploie parfois de la N-lauroyl sarcosine en vue de séparer l?ARN des ribonucléoprotéines. La lyse des parois des bactéries et des levures peut être réalisée à l?aide d?enzymes telles que le lysozyme ou la lyticase, la glucalase ou la zymolase, respectivement. Dans certains cas, une lyse des bactéries peut être obtenue par une simple sonication. Pour les cellules et tissus qui s?avèrent difficiles à isoler par les méthodes conventionnelles, il existe un instrument, le FastPrep FP120® (Qbiogene) possédant un moteur alternatif et mettant en ?uvre une combinaison de matrices et d?agents chaotropiques pour homogénéiser simultanément les tissus, lyser les cellules et stabiliser l?ARN en quelques secondes. L?agitation rapide conduit à une lyse efficace d?une grande variété de matériaux. Chaque kit FastRNA® (Qbiogene) contient différents types de matrices : particules de silice (pour les bactéries), de céramique (pour les levures, champignons et algues), ou de zirconium (pour les tissus animaux et végétaux). Dans la plupart des cas, la lyse est réalisée dans des conditions dénaturantes pour casser les cellules. En outre, la plupart des agents dénaturants utilisés sont de puissants inhibiteurs des RNAses. Initialement, la méthode de référence décrite par Chirgwin et al. en 1979 homogénéisait les prélèvements dans une solution 4 M de thiocyanate de guanidinium, agent puissant de dénaturation des protéines, additionné de beta2-mercaptoéthanol qui permet de rompre les ponts disulfures protéiques [11]. Chomczynski et Sacchi ont ensuite amélioré cette méthode pour accélérer la procédure d?extraction en combinant lyse au thiocyanate de guanidinium à la phase d?extraction au phénol-chloroforme (voir ci-dessous) [12]. Cette modification s?est avérée particulièrement intéressante lors de la réalisation de grandes séries d?échantillons ou lorsque l?on ne dispose que de petites quantités cellulaires ou tissulaires. À l?heure actuelle, la plupart des coffrets disponibles sur le marché reposent sur ces deux principes avec des proportions de thiocyanate de guanidinium et phénol-chloroforme qui leur sont propres (tableau 1). L?utilisation de solvant organique peut entraîner la perte ou la fragmentation de l?ARN. De même, des résidus salins provenant du thyristor de guanidinium peuvent interférer sur les résultats en modifiant la vitesse et l?efficacité des réactions enzymatiques ultérieures. Ainsi, certains coffrets offrent une méthode alternative de lyse utilisant des détergents en lieu et place du thiocyanate de guanidinium
C'est bien beau, le copier/coller, mais sans les schémas et la référence de la copie, merci pour le demandeur, qui n'a pas dû comprendre que le chloroforme sert à solubliser (et concentrer) un type de produits, et l'extraire d'un mileu aqueux complexe.
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